طراحی و بهینه‌سازی واکنش زنجیر‌های پلیمراز چندگانه جهت تکثیر

زمینه و هدف: آنتی‌بادی‌‌ها در بسیاری از حوزه‌‌های تشخیص و درمان مورد استفاده قرار می‌گیرند. آنتی‌بادی‌‌های کاملاً انسانی به دلیل عدم برانگیختن پاسخ ایمنی در بدن بسیار مورد توجه قرار دارند. این مطالعه با هدف طراحی و بهینه‌سازی واکنش زنجیر‌های پلیمراز چندگانه جهت تکثیر ژن‌‌های آنتی‌بادی انسانی علیه توکسوئید کزاز انجام شد. روش بررسی: پس از خونگیری از انسان ایمن‌شده با توکسوئید کزاز و جداسازی لمفوسیت‌‌ها، RNA استخراج و cDNA ساخته شد. طی دو واکنش PCR چندگانه و با استفاده از 14 جفت پرایمر، همه تنوع ژن‌‌های ناحیه متغیر زنجیره‌‌های سبک (کاپا) و سنگین آنتی‌بادی تکثیر شد. واکنش PCR جهت اتصال قطعات VH و VL به‌صورتScFv  و واکنش  Semi Nested PCR جهت افزودن جایگاه برش آنزیم محدودالاثر به دو انتهای قطعه انجام شد. یافته‌‌ها: در انجام دو واکنش Multiplex PCR ، دو قطعه VH و VL به ترتیب به اندازه‌های bp410 و 680 تکثیر شد. با واکنشOverlap Extension PCR، دو قطعهVH  و VL به‌صورت ScFv به‌هم متصل و قطعه bp1070 به‌ دست آمد. در نتیجه انجام واکنش Semi Nested PCR، جایگاه برش به دو انتهایScFv  اضافه شد. نتیجه‌گیری: با انتخاب مجموعه پرایمر مناسب و بهینه‌سازی عوامل موثر در Multiplex PCR، می‌توان با دو واکنشMultiplex PCR  جداگانه به جای چند واکنش Uniplex، همه تنوع‌های ژن‌های آنتی‌بادی به‌ دست آمده از میان cDNA تام لمفوسیت انسانی را تکثیر و جداسازی نمود، لذا می‌توان تنها با استفاده از دو واکنش Multiplex PCR، تمامی‌ تنوع‌‌های ژنتیکی آنتی‌بادی انسانی را به‌صورت قطعات VH و VL از خون فرد ایمن‌شده با توکسوئید کزاز تکثیر کرد.